化妝品、藥品、化學(xué)品等工業(yè)制備中有一種重要的中間體，就是苯甲醇。傳統(tǒng)用化學(xué)法生成苯甲醇的工藝過程繁瑣，且會生成大量污染環(huán)境的副產(chǎn)物。苯甲醇能否實現(xiàn)綠色高效生產(chǎn)，一直是工業(yè)界和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問題。

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室教授李愛濤、陳純琪和郭瑞庭團(tuán)隊合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了萬能酶——細(xì)胞色素P450tol及其復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)，并基于此構(gòu)建了一種活性和穩(wěn)定性均明顯提升的人工融合酶，實現(xiàn)了苯甲醇的高效綠色合成。相關(guān)研究成果2月14日在線發(fā)表于《美國化學(xué)會志—催化》，并被選為封面文章。

萬能酶P450的神奇定向進(jìn)化

論文通訊作者李愛濤告訴《中國科學(xué)報》，苯甲醇工業(yè)生產(chǎn)采取兩步法，以甲苯為原料，用劇毒的氯氣和強堿氫氧化鈉，才能實現(xiàn)甲苯中惰性C-H鍵的官能團(tuán)化，制備出苯甲醇。

“C-H鍵具有較高的解離能、較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和較低的化學(xué)反應(yīng)性，因此，C-H鍵官能團(tuán)化是傳統(tǒng)化學(xué)合成中一個極大的難題。”李愛濤說。

能不能找到一種辦法，將甲苯綠色高效地轉(zhuǎn)化為苯甲醇呢?李愛濤及其團(tuán)隊想到了酶這種地球生命中最強大的化學(xué)工具。

通過理性設(shè)計和定向進(jìn)化手段，酶展現(xiàn)出在生物催化領(lǐng)域的強大功能。其中，細(xì)胞色素P450酶能夠識別多種參與生化反應(yīng)的物質(zhì)(即底物)，利用基因工程改造P450酶來量身定制化學(xué)反應(yīng)，成為一個熱門研究方向。2018年諾貝爾化學(xué)獎得主阿諾德，就是利用P450酶的定向進(jìn)化實現(xiàn)了各種特殊的化學(xué)反應(yīng)而獲獎。

在前期研究中，李愛濤從甲苯降解菌中鑒定出一種特殊的P450酶，命名為P450tol。它以甲苯為底物，生成專一的產(chǎn)物苯甲醇。這是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。然而，P450tol三維結(jié)構(gòu)信息的缺乏，限制了針對P450tol的基礎(chǔ)研究與未來的應(yīng)用。

揭開特殊P450酶的神秘面紗

改造高效的P450tol，必須先揭開酶結(jié)構(gòu)的面紗。

2020年5月，郭瑞庭團(tuán)隊在世界上首次解析了一種自給自足P450酶的全長晶體結(jié)構(gòu)，獲得了廣泛關(guān)注。為此，李愛濤團(tuán)隊和郭瑞庭團(tuán)隊展開了合作。郭瑞庭說，這次合作解開了P450tol的結(jié)構(gòu)謎團(tuán)。

在這項研究中，郭瑞庭、陳純琪團(tuán)隊順利解析了P450tol的空結(jié)構(gòu)及其與底物甲苯及產(chǎn)物苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。通過這些結(jié)構(gòu)信息，精準(zhǔn)揭示了P450tol由甲苯通過一步反應(yīng)生成苯甲醇且沒有副產(chǎn)物生成的酶結(jié)構(gòu)與催化機制。

陳純琪告訴《中國科學(xué)報》，P450酶的活性區(qū)都會帶一個血紅素分子參與催化反應(yīng)，這次解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個氨基酸分別位于底物的兩側(cè)，牢牢鉗住了甲苯的苯環(huán)，甲苯前方還有一個氨基酸負(fù)責(zé)固定整個甲苯的位置。

“這樣，催化反應(yīng)發(fā)生時就可以精確地發(fā)生在芐基位，而不是其他任意的位置。如此精巧的反應(yīng)也只有酶可以做到。”陳純琪說。

他們在P450tol與苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)中看到了類似的現(xiàn)象，只不過苯甲醇的羥基代替甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子。

“我們還觀察到了一個非常有意思的現(xiàn)象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區(qū)完全占據(jù)，還有一些多余的空間，所以我們猜測P450tol或許可以結(jié)合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陳純琪說。

進(jìn)一步實驗結(jié)果與推測的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復(fù)合體，且可以精確地在芐基位發(fā)生羥基化反應(yīng)。

所有這些結(jié)果顯示，底物會以有利于反應(yīng)發(fā)生的方式結(jié)合并參與反應(yīng)，這也使酶的反應(yīng)更精準(zhǔn)而高效。

人工融合酶催化苯甲醇綠色合成

李愛濤告訴記者，自然界中大部分P450酶都需要一個能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發(fā)生催化反應(yīng)，這對于后續(xù)應(yīng)用是一個難題。

為了實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構(gòu)建高效的自給自足型P450人工融合酶，成為科研工作者關(guān)注的焦點。

“2020年5月郭瑞庭團(tuán)隊解析了自給自足型P450酶(CYP116B46)的全長晶體結(jié)構(gòu)，給我們構(gòu)建自給自足型人工融合酶帶來了非常大的啟發(fā)。”李愛濤說，他們將P450tol和CYP116B46的還原酶結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建出一個新的自給自足型人工融合酶。

新的酶不論在酶活性、穩(wěn)定性還是半衰期方面，都獲得了很大的提升，且兩種融合酶具有相似的底物親和力。

“目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報道的穩(wěn)定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有望應(yīng)用于實際的工業(yè)生產(chǎn)中。”李愛濤說，最近已經(jīng)有企業(yè)向他們伸出了橄欖枝，表示對該項技術(shù)很感興趣，有意向進(jìn)行下一步研發(fā)或中試。

“不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯，形成羥基化產(chǎn)物，其中有些是非常重要的藥物中間體。”李愛濤說，基于P450tol的三維結(jié)構(gòu)，他們使用蛋白質(zhì)工程的手段理性設(shè)計和改造，使其反應(yīng)更多地朝對人類有益的方向發(fā)生。

3位審稿人在審稿意見中都贊同該文利用酶的生物催化來準(zhǔn)確生成苯甲醇，還指出作者構(gòu)建了非常穩(wěn)定的人工融合酶，將來應(yīng)用到綠色生物催化制程中，具有非常大的潛力。

“隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能、酶定向進(jìn)化等領(lǐng)域的發(fā)展，通過理性設(shè)計和改造，獲得更多新的、具有重要功能的酶造福人類，將是一個重要的研究和發(fā)展方向。我們將繼續(xù)致力于構(gòu)建更多P450tol人工融合酶，期待得到更具挑戰(zhàn)的、反應(yīng)和性能獲得極大提升的新酶。”郭瑞庭說。(記者 李晨)

關(guān)鍵詞： 化學(xué)法生成苯甲醇 綠色高效生產(chǎn) C-H鍵的官能團(tuán)化